液相色譜儀作為一種高精密儀器，如果在使用過程中操作不當?shù)脑挘腿菀讓е乱恍﹩栴}。

1.氣泡

由于HPLC系統(tǒng)中氣泡的存在，會造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰，嚴重時會造成分析靈敏度下降；氣泡變大進入流路或色譜柱時會使流動相的流速變慢或不穩(wěn)定，使基線起伏。造成上述現(xiàn)象的主要原因有三條：一是流動相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡；二是系統(tǒng)開始工作時未能將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；三是在注入樣品時不注意混入了空氣。

為了避免這類問題的出現(xiàn)，HPLC實際分析過程中必須重視對流動相進行脫氣處理；在HPLC系統(tǒng)開始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽入流動相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。

2.柱溫

在操作HPLC時，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，溫度的差別就會引起較復雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脫方式受溫度的影響。

等度洗脫時溫度會影響保留時間，當溫度升高時所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時一般溫度每升高１℃，保留時間會縮短(1~3)％。溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。溫度變化對梯度洗脫的影響要小于對等度洗脫的影響。即便如此，若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般也會有較大的變化。溫度變化還可能引起選擇性顯著變化。

正如柱子不能平衡將導致保留時間的重現(xiàn)性差一樣，柱溫不平衡也會導致不理想的后果，這個問題在峰寬上的影響尤其明顯。當溫度變化時除了選擇性和保留時間的變化之外，峰寬也會發(fā)生變化。升高溫度通常會使理論塔板數(shù)升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會越高，因此升高溫度可以達到更小的檢測限。

柱子里的溫度變化也會影響峰形。當流動相和柱子之間的溫差增大時，由溫度不平衡而導致的峰變形就會加劇。

為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是較好的辦法。如果沒有柱溫箱，較有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個溫度波動較小的地方。

3.色譜柱污染

色譜柱污染會引起保留時間漂移。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可能是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。

樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能使保留時間漂移。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加。可以通過使用固相提取等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。

避免色譜柱污染較簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。

使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

4.色譜柱平衡

如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相*平衡。通常平衡需要10~20個柱體積的流動相。但如果在流動相中加入少量添加劑則需要相當長的時間來平衡色譜柱。需要柱子的充分平衡，然后才能對HPLC進行檢定。

5.流動相有機溶劑

HPLC分析總要求使用HPLC純的試劑，關(guān)鍵是兩點：純度高、紫外吸收小。純度高，是希望沒有雜質(zhì)干擾HPLC分析；不會有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)。可以通過重蒸分析純?nèi)軇?；或濾膜過濾，并定期把前置的過濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性。流動相有機溶劑可能影響HPLC的檢測限。

6.柱壓

柱壓過高是HPLC分析中常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題。溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升，應更換柱子入口篩板；泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理；比例閥失效，應更換比例閥；泵密封墊損壞，應更換密封墊；系統(tǒng)檢漏，則找出漏點，密封即可。

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下，峰形應對稱而尖銳。充分考慮到可能影響分析結(jié)果的因素，可以科學地進行液相色譜儀的檢定。